Modulación de la miosina por la proteína de unión a la miosina cardíaca - Shenyang VisionaryPeak Ventures Co., Ltd.

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 4337 (2022) Citar este artículo

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La proteína C fijadora de miosina cardíaca (cMyBP-C) es un importante regulador de la función sarcomérica. La fosforilación reducida de cMyBP-C se ha relacionado con contractilidad comprometida en pacientes con insuficiencia cardíaca. Aquí, utilizamos los péptidos 302A y 302S de cMyBP-C publicados anteriormente, sustitutos del sitio regulador de fosforilación serina 302, como una herramienta para determinar los efectos de la modulación del estado de desfosforilación de cMyBP-C en la contracción y relajación cardíaca en insuficiencia cardíaca experimental (HF ) modelos in vitro. Ambos péptidos aumentaron la contractilidad de las fibras musculares papilares aisladas de un modelo de ratón que expresaba fosfoablación de cMyBP-C (cMyBP-CAAA) de forma constitutiva. El péptido 302A, en particular, también podría mejorar la tasa de redesarrollo de la fuerza (ktr) en las fibras musculares papilares de ratones cMyBP-CAAA (alaninas no fosforiladas). De acuerdo con los hallazgos anteriores, ambos péptidos aumentaron las tasas de ATPasa en miofibrillas aisladas de ratas con infarto de miocardio (IM), pero no de ratas simuladas. Además, en el modelo de ratón cMyBP-CAAA, ambos péptidos mejoraron las tasas de hidrólisis de ATPasa. Estos cambios no se observaron en ratones no transgénicos (NTG) ni en ratas simuladas, lo que indica los efectos específicos de estos péptidos en la regulación del estado de desfosforilación de cMyBP-C en las condiciones patológicas de la IC. En conjunto, estos estudios demuestran que la modulación del estado de desfosforilación de cMyBP-C puede ser un enfoque terapéutico para mejorar la función de la miosina, la contractilidad del sarcómero y la relajación después de un evento cardíaco adverso. Por lo tanto, apuntar a cMyBP-C podría mejorar potencialmente el rendimiento cardíaco general como complemento a los medicamentos de atención estándar en pacientes con insuficiencia cardíaca.

La proteína C fijadora de miosina cardíaca (cMyBP-C) es una proteína de filamento grueso sarcomérico de 140 kDa que se localiza en intervalos regulares en la zona C del sarcómero para regular la estructura y función del sarcómero en el corazón1,2. La regulación de cMyBP-C surge de tres sitios de fosforilación en el dominio M y la interacción de su región N-terminal con miosina y actina3,4. Si bien cMyBP-C está altamente fosforilado en condiciones fisiológicas normales, sus niveles de fosforilación disminuyen en estados de enfermedad5. Esto se puede observar tanto en modelos preclínicos de insuficiencia cardíaca (IC) como, clínicamente, en pacientes con miocardiopatía hipertrófica (MCH), IC o fibrilación auricular6. A pesar de los claros beneficios de dirigirse a cMyBP-C, actualmente no hay ningún fármaco disponible para modificar directamente cMyBP-C desfosforilado para mejorar la función cardíaca.

Las proteínas cMyBP-C humanas y de ratón tienen tres sitios principales de fosforilación, más de 17 sitios en total7,8. Estos están ubicados en el dominio M en el extremo N de la molécula, y todos están ausentes de la isoforma del músculo esquelético9. La región del extremo N se une al segmento S2 de la miosina, cerca del dominio del brazo de palanca10,11. Esta interacción puede regularse dinámicamente mediante la fosforilación/desfosforilación de cMyBP-C. En condiciones fisiológicas, la cMyBP-C fosforilada facilita la activación del ciclo de puentes cruzados, uniendo los filamentos sarcoméricos gruesos y delgados12. Sin embargo, cuando cMyBP-C se desfosforila en condiciones de enfermedad, interactúa fuertemente con la miosina, evitando así su interacción generadora de fuerza con la actina13,14,15. De manera similar, la escisión catalítica de la región N-terminal de cMyBP-C durante el IM reduce el número de sitios de fosforilación, lo que conduce a una reducción de la contractilidad y función cardíacas16.

Estudios previos han determinado la necesidad y suficiencia de la fosforilación de cMyBP-C para regular la función cardíaca normal17,18,19,20. Estos estudios utilizaron ratones transgénicos (TG) específicos para el corazón que expresaban cMyBP-C fosfoablada en los sitios Ser-273-Ala/Ser-282-Ala/Ser-302-Ala (AAA) o cMyBP-C fosfomimético en Ser- 273-Asp/Ser-282-Asp/Ser-302-Asp (DDD) en comparación con ratones de control no transgénicos (NTG). Por lo tanto, para apuntar terapéuticamente a cMyBP-C para mejorar la función cardíaca después de un evento cardíaco adverso, usamos modelos preclínicos, como se informa en la literatura. En el primer modelo, los tres sitios de fosforilación de serina (273, 282 y 302) se mutaron a alaninas no fosforilables (AAA)18. En otro modelo, se mutaron a ácidos aspárticos fosfomiméticos (DDD)19 para imitar el estado fisiológico del corazón. El reemplazo de AAA resultó en una función cardíaca deprimida de tal manera que la proteína no pudo rescatar el fenotipo nulo de cMyBP-C18, mientras que la sustitución de DDD pudo rescatar el fenotipo nulo de cMyBP-C19. El ratón transgénico expresó cMyBP-C de tipo salvaje sirvieron como controles de NTG.

Aquí, probamos los péptidos diseñados en función del dominio M de cMyBP-C21. Presumimos que los péptidos probablemente interrumpirían la interacción de cMyBP-C y la miosina, mejorando así la interacción de la cabeza de miosina con el filamento delgado y, por lo tanto, el golpe de potencia. Los péptidos cMyBP-C probados podrían interrumpir la estrecha interacción entre cMyBP-C y la miosina, liberando los filamentos gruesos para reanudar su interacción con los filamentos delgados para mejorar la contractilidad muscular. De hecho, permeabilizando 302A, sustituto del sitio de fosforilación en 302, el péptido inhibió la interacción de la miosina con cMyBP-C, lo que resultó en su movimiento hacia la actina, lo que a su vez resultó en la formación de interacciones de actomiosina y puentes cruzados, mejorando así la contractilidad. En conjunto, la evaluación del péptido 302A in vitro condujo al descubrimiento de una mejor generación de fuerza y sensibilidad al calcio en las fibras musculares cardíacas. Sin embargo, los mecanismos subyacentes a la mejora de la cinética contráctil en relación con el estado de fosforilación de cMyBP-C no se han dilucidado por completo. En condiciones patológicas, planteamos la hipótesis, como se sugirió anteriormente, de que el péptido 302A modifica las propiedades de unión de cMyBP-C en su estado desfosforilado para mejorar la cinética cardíaca. Para probar esta hipótesis, los efectos de los péptidos cMyBP-C 302A y 302S se evaluaron en tres ensayos in vitro diferentes: un ensayo de ATPasa en estado estacionario, un ensayo de ATPasa de miofibrillas y un ensayo de músculo papilar. Los datos generados a partir de ensayos in vitro y modelos preclínicos de HF brindan una fuerte evidencia de que la modulación de cMyBP-C y, en consecuencia, su estado de fosforilación, aumenta la actividad de ATPasa y la cinética de fuerza de una manera que mejora el rendimiento cardíaco general.

Para probar el efecto del estado de fosforilación de cMyBP-C en el modelo de rata MI-HF, recolectamos muestras de proteínas de la zona de infarto del ventrículo izquierdo (LV) de ratas MI y un área comparable de animales simulados en cinco puntos de tiempo diferentes después de la cirugía MI. : día 1, día 3, semana 1, semana 4 y semana 8. Los parámetros funcionales cardíacos globales se midieron en cuatro puntos temporales (día 3, semana 1, semana 4 y semana 8) después de la cirugía de infarto de miocardio para confirmar el desarrollo de insuficiencia cardíaca (Figura complementaria S1). La fosforilación de cMyBP-C se detectó usando anticuerpos dirigidos específicamente a los sitios de fosforilación de serina en las posiciones 273, 282 y 302, así como anticuerpos para detectar los niveles totales de expresión de cMyBP-C (Fig. 1, Figs. complementarias S2–7). La alfa-actina se usó como proteína de limpieza para la normalización en el día 1 y el día 3. La HPRT se usó como proteína de limpieza para la normalización en la semana 1, la semana 4 y la semana 8 después del IM, debido a la reducción significativa de la alfa-actina. niveles en la semana 1 después del IM (Figura complementaria S8). Los hallazgos sugieren que los niveles de expresión de cMyBP-C total, junto con los tres residuos de serina fosforilados (p273, p282 y p302), se redujeron significativamente en los primeros momentos (día 1 y día 3), seguidos de una tendencia a la reducción en Muestras posteriores al IM de la semana 1 (Fig. 1, Figs. complementarias S2–S5). Sorprendentemente, la expresión de los tres sitios de fosforilación aumentó en puntos de tiempo posteriores (muestras posteriores al IM de la semana 4 y la semana 8; Fig. S2 complementaria), excepto p273 en la semana 8, posiblemente como resultado de un efecto compensatorio a medida que avanzaba la insuficiencia cardíaca. Notamos que la expresión de cMyBP-C total siguió de cerca la tendencia de los cambios de fosforilación de cMyBP-C (Fig. 1, Fig. S2 complementaria), lo que indica que el efecto principal de la lesión cardíaca fue en la expresión total de cMyBP-C. Por lo tanto, calculamos la proporción de fosfositos de cMyBP-C (p273, p282 y p302) a la expresión total de cMyBP-C (Fig. S8 complementaria). La fosforilación de los sitios de cMyBP-C (p273 y p282) a cMyBP-C total no cambió el día 1 después del IM, pero aumentó significativamente en los tres fosfositos (p273, p282 y p302) el día 3, semana 1, semana 4 y la semana 8 después de un infarto de miocardio en comparación con el tratamiento simulado. Además, también probamos la expresión de troponina T y troponina I, que también mostró una reducción constante en todos los puntos de tiempo (Figura complementaria S9). Curiosamente, la expresión reducida de la cadena pesada de miosina (MHC) se retrasó y se observó solo el día 3 después del IM. Se produjo una compensación rápida en la expresión de MHC con un aumento espectacular en puntos de tiempo posteriores (semana 4 y semana 8 después del IM; figura complementaria S9).

La fosforilación de cMyBP-C se redujo en el día 1 y el día 3, pero no en la semana 1 en ratas post-IM en comparación con el tratamiento simulado. (A) Western blot (Wes) de cMyBP-C fosforilado probado con anticuerpos p273, p282, p302 de fosfo cMyBP-C específicos del sitio, anticuerpos cMyBP-C totales y anticuerpos de proteína de mantenimiento alfa-actina o HPRT. Se usaron homogeneizados completos de tejido de infarto del ventrículo izquierdo de ratas MI y la misma área de ratas simuladas para Wes. Cada carril representa un capilar individual cargado con la misma cantidad de proteínas. Las imágenes originales de Wes de longitud completa se presentan en las figuras complementarias. S3–S5. (B) Cuantificación de cMyBP-C p273, p282 y p302 normalizados a proteínas de mantenimiento. Los datos representan medias ± SEM (N = 6–8). ** p < 0,01; *** p < 0,005; **** p < 0,001; Prueba t de Student de dos colas para datos no apareados.

Para probar el estado de fosforilación de cMyBP-C en HF humana, se realizó inmunohistoquímica (IHC) utilizando secciones de tejido cardíaco de donantes sanos normales, así como pacientes con miocardiopatía hipertrófica (MCH) y miocardiopatía dilatada (MCD) (N = 4 pacientes por grupo , figura 2A). Las muestras de HCM y DCM fueron confirmadas por un fisiólogo capacitado. La IHC se realizó utilizando anticuerpos contra p273 y p282, así como un anticuerpo contra cMyBP-C total. La expresión relativa de p273 se redujo ligeramente en tejidos cardíacos de MCH, pero no de pacientes con MCD (normal 0,72 ± 0,08 frente a MCH 0,48 ± 0,06, p = 0,06; MCD 0,78 ± 0,10; n = 16; fig. 2B). Por otro lado, la expresión relativa de p282 se redujo significativamente tanto en pacientes con MCH como con MCD (normal 1,64 ± 0,16 frente a MCH 0,93 ± 0,06, p < 0,005; normal 1,64 ± 0,16 frente a DCM 1,04 ± 0,11, p < 0,01). Por lo tanto, los datos de IHC de pacientes humanos respaldaron firmemente la reducción de la fosforilación de cMyBP-C en la IC humana.

La inmunohistoquímica de secciones de tejido cardíaco de pacientes con MCH y MCD mostró una fosforilación reducida de cMyBP-C en comparación con donantes sanos. (A) Imágenes IHC de p273 y p282 en muestras de corazón normal, HCM y DCM. (B) Cuantificación correspondiente de p273 y p282 en todas las muestras de corazón. Los valores de p273 y p282 se normalizaron a valores totales de cMyBP-C. Los datos representan la media ± SEM (N = 4 pacientes, n = 16 imágenes). La barra de escala en las cifras representa 20 µm. DCM, miocardiopatía dilatada; MCH, miocardiopatía hipertrófica: IHC, inmunohistoquímica. ** p < 0,01; *** p < 0,005; ANOVA unidireccional con post-test de Tukey.

Los efectos de los péptidos 302A y 302S de cMyBP-C (Tabla 1) en la modulación de cMyBP-C se probaron en tres ensayos in vitro diferentes. El ensayo de ATPasa en estado estacionario involucró miosina, actina y cMyBP-C de longitud completa (FL), o proteínas recombinantes C0-C2 truncadas (no fosforiladas [-P] o fosforiladas [+P]). La actividad ATPasa se midió detectando el Pi liberado de la hidrólisis de ATP. Se observó inhibición de la actividad de miosina ATPasa con concentraciones crecientes de proteínas C0-C2 y FL cMyBP-C (Fig. 3A, C). C0-C2 fue mucho más potente en la inhibición de la actividad ATPasa en comparación con la proteína FL cMyBP-C (3,16 ± 0,18 frente a 6,66 ± 0,11 µM). Aunque la proteína fosforilada, ya sea C0-C2 o FL, desplazó la curva de inhibición hacia la derecha, ni el péptido 302A ni el péptido 302S mejoraron la actividad de miosina ATPasa probada a varias concentraciones (Fig. 3B, D). Estos resultados sugieren que las proteínas recombinantes del sarcómero miosina y actina solas en presencia de los péptidos pueden no ser suficientes para afectar la actividad de la ATPasa y permitir la función sarcomérica. En cambio, los péptidos cMyBP-C solo podrían volverse funcionales y mejorar la actividad ATPasa in vitro en presencia de una arquitectura de sarcómero intacta más desarrollada.

Los péptidos cMyBP-C no tienen efecto en el ensayo de ATPasa en estado estacionario con cMyBP-C C0C2 truncado o FL cMyBP-C. (A) La cMyBP-C FL desfosforilada inhibía la actividad de miosina ATPasa más que la inhibición de la miosina por cMyBP-C fosforilada. (B) Los péptidos cMyBP-C 302A o 302S no tuvieron efecto sobre la actividad cMyBP-C de miosina ATPasa FL. (C) cMyBP-C C0-C2 desfosforilado inhibía la actividad de miosina ATPasa, pero no cMyBP-C fosforilado. (D) Los péptidos cMyBP-C 302A o 302S no tuvieron ningún efecto sobre la actividad de miosina ATPasa de CO-C2. Los datos representan la media ± SEM (N = 4–12). FL, de cuerpo entero. Scr, revueltos.

Para examinar más a fondo el papel de cMyBP-C en la actividad de la ATPasa con un sarcómero intacto, aislamos miofibrillas de muestras de corazón de ratas falsas y ratas de la semana 1 después del IM en las que las proteínas del sarcómero están presentes en el estado nativo. Mediante electroforesis en gel, se confirmó la integridad del sarcómero completamente intacto al verificar la presencia de todas las proteínas miofibrilares clave, incluidas MHC, cMyBP-C, actinina, troponina T, α-tropomiosina, así como las proteínas de cadena ligera de miosina (MLC) ( Figura complementaria S10A). Observamos una reducción constante en la fosforilación de cMyBP-C p273, p282 y p302 en las miofibrillas desde la semana 1 después del IM en comparación con las miofibrillas aisladas de animales simulados (Figs. Suplementarias S10B-D, S11), sin cambiar los otros principales Proteínas de sarcómero (Figura complementaria S10E, F). Luego evaluamos los efectos de los péptidos cMyBP-C en el ensayo de ATPasa miofibrilar, en el que los péptidos pueden interactuar con las proteínas del sarcómero intactas (Fig. 4). Se observó una reducción significativa en la actividad de miosina ATPasa en las proteínas miofibrilares aisladas de la región del infarto MI en comparación con las proteínas miofibrilares aisladas de las regiones simuladas o MI-remotas (simulado 159,8 ± 12,59 frente a MI remoto 144,1 ± 9,81 frente a MI infartado 67,8 ± 12,18 , p < 0,005, figura 4A). Mientras tanto, ninguno de los péptidos (revueltos, 302A o 302S) mostró ningún efecto sobre las proteínas miofibrilares de los corazones falsos (Fig. 4B). Por el contrario, los péptidos 302A y 302S de cMyBP-C mejoraron la actividad ATPasa máxima en miofibrillas de corazones con infarto en la semana 1 después del IM de 60,9 ± 5,3 nmol Pi/min/mg (falso, n = 15) a 87,9 ± 7,1 nmol Pi/ min/mg (302A, n = 12; p < 0,05) y 91,3 ± 6,2 nmol Pi/min/mg (302S, n = 12; p < 0,05), respectivamente (Fig. 4C).

La actividad de ATPasa de miofibrillas aumentó con los péptidos cMyBP-C 302A y 302S en la semana 1 en ratas post-IM, pero no en ratas simuladas. (A) La actividad de la ATPasa se redujo más del 50 % en las miofibrillas de la zona de infarto MI, pero no se modificó en las miofibrillas de la zona remota MI en comparación con las miofibrillas de corazones falsos (izquierda). La actividad de ATPasa de miofibrillas se normalizó mediante la proteína de miofibrillas utilizada en el ensayo. La actividad ATPasa máxima en pCa 2,0 se representó en el gráfico de barras (centro). El pCa50 también se representó gráficamente para probar la sensibilidad al calcio (derecha). (B) Los péptidos cMyBP-C 302A y 302S no cambiaron la actividad máxima de ATPasa en miofibrillas aisladas de ratas simuladas (izquierda y centro). No se observaron cambios en la sensibilidad al calcio en ninguno de los grupos de tratamiento en muestras simuladas (derecha). (C) Los péptidos cMyBP-C 302A y 302S aumentaron la actividad ATPasa máxima en miofibrillas aisladas de la zona de infarto de ratas post-IM de la semana 1 en comparación con el control sin tratamiento y las miofibrillas tratadas con péptidos revueltos (izquierda y centro). No se observaron cambios en la sensibilidad al calcio en ninguno de los grupos de tratamiento en muestras MI (derecha). Los datos representan la media ± SEM (N = 8–15); *p < 0,05; *** p < 0,005; ANOVA unidireccional con post-test de Tukey. IM, infarto de miocardio.

A continuación, investigamos la actividad de ATPasa y el papel de cMyBP-C en miofibrillas aisladas de modelos de ratones transgénicos cMyBP-C AAA y DDD (Fig. 5). La actividad de miosina ATPasa aumentó significativamente en las miofibrillas de ratones DDD (131,2 ± 9,33 nmol Pi/min/mg) en comparación con las miofibrillas de NTG (93,98 ± 7,85 nmol Pi/min/mg, p < 0,01) y AAA (71,06 ± 6,25 nmol Pi /min/mg) ratones (Fig. 5A). De acuerdo con los datos simulados, ninguno de los péptidos (revueltos, 302A y 302S) mejoró la actividad ATPasa en miofibrillas de ratones NTG (Fig. 5B). Por otro lado, los péptidos 302A y 302S mostraron un aumento de la actividad ATPasa máxima de 62,74 ± 4,27 nmol Pi/min/mg (control, n = 11) y 58,58 ± 6,67 nmol Pi/min/mg (revuelto, n = 10) a 94,29 ± 11,01 nmol Pi/min/mg (302A, n = 10) y 95,05 ± 10,02 nmol Pi/min/mg (302S, n = 10), lo que representa un aumento del 61 % (302A) y del 62 % (302S) desde , respectivamente (Fig. 5C). Ni cMyBP-C 302A ni el péptido 302S afectaron la sensibilidad al calcio en modelos preclínicos de insuficiencia cardíaca con infarto de miocardio o AAA.

Efecto de los péptidos cMyBP-C 302A y 302S en ratones NTG y TG. (A) La actividad ATPasa es mayor en los ratones DDD TG en comparación con los ratones NTG. La actividad ATPasa disminuyó en ratones AAA TG (izquierda). La actividad ATPasa máxima en pCa 2,0 se representó en el gráfico de barras (centro). El pCa50 también se representó gráficamente para probar la sensibilidad al calcio (derecha). (B) Ni el péptido cMyBP-C 302A ni el 302S cambiaron la actividad ATPasa máxima en miofibrillas aisladas de ratones simulados (izquierda y centro). No se observaron cambios en la sensibilidad al calcio en ninguno de los grupos de tratamiento en muestras simuladas (derecha). (C) Los péptidos 302A y 302S de cMyBP-C aumentaron la actividad máxima de la ATPasa en las miofibrillas aisladas de los ratones transgénicos en comparación con el control sin tratamiento o las miofibrillas tratadas con péptidos revueltos (izquierda y centro). No se observaron cambios en la sensibilidad al calcio en ninguno de los grupos de tratamiento en las muestras de TG (derecha). Los datos representan la media ± SEM (N = 8–15); *p < 0,05; *** p < 0,005; ANOVA unidireccional con post-test de Tukey. TG, ratones transgénicos.

Extendimos los hallazgos de las miofibrillas para investigar en el músculo papilar, que estaría más cerca de la condición in vivo para determinar si los péptidos sintéticos cMyBP-C podrían afectar la función del sarcómero. Para lograr esto, se midió la relación pCa-fuerza en músculos papilares de corazones de ratones AAA y DDD a los 3 meses de edad en comparación con controles NTG de la misma edad (Fig. 6). En comparación con las fibras NTG y DDD, encontramos que las fibras AAA mostraron un déficit significativo en el desarrollo de fuerza máxima en pCa 4.5, así como una disminución significativa en la sensibilidad al calcio, lo que sugiere déficits mecánicos en los niveles de miofilamento (Fig. 6A-E). De acuerdo con las mediciones de la actividad de la ATPasa de la miofibrilla, la incubación con péptido 302S 25 µM o 50 µM mejoró significativamente la producción de fuerza en las fibras papilares AAA, mientras que el péptido 302A también aumentó la fuerza, pero no significativamente (p = 0,0514) (Fig. 6D, Fig. S12A complementaria) ). Los péptidos 302S y 302A mostraron una eficacia significativa en la mejora de la sensibilidad al calcio en las fibras AAA (Fig. 6E, Fig. S12B complementaria). También probamos un péptido cMyBP-C fosfo-mimético 302D, que no mejoró la producción de fuerza en las fibras papilares NTG, AAA o DDD (Figura complementaria S13). Para caracterizar aún más los efectos de los péptidos 302A y 302S en la función cardíaca, realizamos una medición de la tasa de redesarrollo de fuerza (ktr) como una medida indirecta de relajación. El péptido 302A, pero no el 302S, mejoró la actividad de ktr, lo que indica que este último solo afecta a la contractilidad, no a la relajación (Fig. 6F). Los efectos mejorados en ktr también se observaron con el péptido 302A a 25 µM (Fig. S12C complementaria).

La función cardíaca mejoró con los péptidos cMyBP-C 302A y 302S en fibras musculares aisladas de ratones transgénicos AAA, pero no en ratones NTG o DDD TG. Fuerza las curvas de pCa (A–C) generadas a una longitud de sarcómero de 2,0 μM en presencia de diferentes péptidos (50 μM). La producción de fuerza máxima (D, mN/mm2), la sensibilidad al calcio (E, pCa50) y la tasa de regeneración de fuerza (F, ktr) se midieron en presencia de diferentes péptidos (50 μM) en NTG (barra blanca), AAA ( barra roja) y DDD (barra verde). N = 4 fibras papilares por tratamiento con péptido de 4 animales por grupo. *p < 0,05 ANOVA unidireccional con post-test de Tukey. AAA, alaninas no fosforiladas; DDD, ácidos aspárticos fosfomiméticos; NTG, ratones no transgénicos. Scr, revueltos.

cMyBP-C es un regulador clave de la contractilidad cardíaca con más de 300 mutaciones en el gen MYBPC3 directamente relacionado con el desarrollo de miocardiopatía e insuficiencia cardíaca22,23. Aunque se ha demostrado que la fosforilación de cMyBP-C disminuye significativamente en condiciones patológicas en modelos preclínicos y clínicos, no se ha informado sobre el cambio dinámico de la expresión de cMyBP-C y su importancia en la cinética cardíaca en diferentes momentos. En este estudio, caracterizamos la dinámica de la desfosforilación de cMyBP-C durante el desarrollo de HF en un modelo MI de rata. La fosforilación de cMyBP-C disminuyó significativamente dentro de 1 semana (el día 1 y el día 3 después del IM, Fig. 1) después de la lesión cardíaca, pero aumentó significativamente en puntos de tiempo posteriores (semana 4 y semana 8 después del IM, Fig. S2 complementaria) , lo que sugiere un efecto compensatorio en el corazón. La cMyBP-C total también disminuyó en diferentes momentos en el modelo preclínico de insuficiencia cardíaca con infarto de miocardio. Estos hallazgos sugieren que el estado de fosforilación de cMyBP-C es temporal y, cuando se combina con una disminución de la expresión total de cMyBP-C, contribuye al desarrollo de IC. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de la utilidad de las estrategias de intervención dirigidas a cMyBP-C en su estado patógeno desfosforilado en puntos de tiempo relevantes en función de nuestros hallazgos de modelos animales preclínicos. La pérdida aguda de cMyBP-C total en el torrente sanguíneo es consistente con estudios previos, lo que sugiere que cMyBP-C podría servir como un biomarcador de diagnóstico potencial de MI y un marcador de pronóstico de HF24. En pacientes humanos con MCH y MCD, la fosforilación de cMyBP-C está relacionada con el desarrollo de la progresión de la enfermedad25,26. En pacientes con MCH, tanto p273 como p282 estaban reducidos (fig. 2). La jerarquía de los sitios de fosforilación de cMyBP-C ha sido reportada20. Ser-282 tiene un papel regulador único en el sentido de que su fosforilación es fundamental para la fosforilación posterior de Ser-302. Relevante a su importancia en la función de cMyBP-C, observamos una disminución en la fosforilación de ser-282 en pacientes con MCD y MCH (Fig. 2). Ser-273 es fosforilado tanto por la proteína quinasa A (PKA) como por la proteína quinasa C (PKC), a diferencia del ser-282, que es fosforilado principalmente por PKA y CAMKII en concentraciones de calcio no fisiológicas. En pacientes con DCM, existe la posibilidad de compensación en la dinámica de PKA y/o PKC que podría afectar la fosforilación de ser 273. Por lo tanto, esto podría tener un efecto mínimo en pacientes con MCD y no con MCH. Tanto el ser-282 como el ser-302 participan en la aceleración de la cinética de cMyBP-C y son fosforilados por CAMKII. Se ha demostrado que la ablación de la fosforilación de ser282 disminuye la fosforilación de ser-302 por CAMKII. Aunque p302 no se examinó debido a las limitadas muestras de pacientes, nuestros datos indicaron que diferentes sitios de fosforilación podrían verse afectados en pacientes con MCH y MCD.

La fosforilación reducida de cMyBP-C se ha relacionado con contractilidad comprometida en pacientes con insuficiencia cardíaca27. Aquí, utilizamos los péptidos 302A y 302S21 de cMyBP-C publicados anteriormente, sustitutos del sitio regulador de fosforilación serina 302, como una herramienta para determinar si la modulación del estado de desfosforilación de cMyBP-C puede mejorar la contracción y la relajación cardíacas en la insuficiencia cardíaca (IC) experimental. modelos Por lo tanto, para caracterizar completamente los efectos de los péptidos en la modulación de cMyBP-C, evaluamos los péptidos en tres ensayos in vitro y ex vivo recombinantes diferentes: un ensayo de ATPasa en estado estacionario, un ensayo de ATPasa de miofibrillas y un ensayo de músculo papilar. En el ensayo de ATPasa en estado estacionario, no se observó ningún cambio en la actividad de ATPasa en ninguno de los grupos de tratamiento (Fig. 3). Sin embargo, cuando se aislaron proteínas de miofibrillas de modelos enfermos, es decir, el modelo MI de rata o el modelo cMyBP-CAAA de ratón, se observó una mejora constante de la actividad ATPasa en los grupos tratados con péptido 302S y 302A (Figs. 4, 5). Esta mejora en la actividad de la ATPasa fue consistente con la mejora de la contractilidad usando fibras musculares papilares aisladas de ratones transgénicos cMyBP-CAAA (Fig. 6). Juntos, estos datos mostraron la necesidad de evaluar las terapias dirigidas a cMyBP-C en condiciones patológicas. Además, los hallazgos anteriores sugirieron fuertemente el requisito de un sarcómero intacto para que la actividad de los péptidos capture adecuadamente la cinética de cMyBP-C y su papel en la modulación de la función cardíaca. La permeabilidad limitada de los péptidos hizo que la inmunolocalización de los péptidos en sarcómeros o miocitos cardíacos intactos no fuera factible.

Dado que observamos los efectos cardíacos mejorados de los péptidos en modelos de HF que habían mostrado una expresión o fosforilación reducida de cMyBP-C, planteamos la hipótesis de que los péptidos probablemente interrumpieron la interacción de cMyBP-C y la miosina, mejorando así la interacción de la cabeza de miosina con el filamento delgado y, por lo tanto, golpe de poder. En condiciones fisiológicas (NTG/DDD o normal), la cMyBP-C fosforilada facilita la activación del ciclo de puentes cruzados, uniendo los filamentos sarcoméricos gruesos y delgados (Fig. 7; panel izquierdo). Sin embargo, cuando cMyBP-C se desfosforila en condiciones de enfermedad (AAA o HF), interactúa fuertemente con la miosina, evitando así su interacción generadora de fuerza con la actina (Fig. 7; panel central). Los péptidos cMyBP-C que probamos podrían interrumpir la estrecha interacción entre cMyBP-C y la miosina, liberando los filamentos gruesos para reanudar su interacción con los filamentos delgados para mejorar la contractilidad muscular (Fig. 7; panel derecho).

Diagrama que muestra el efecto del estado de fosforilación de cMyBP-C en la interacción de la actomiosina frente al efecto de los péptidos 302A y 302S de cMyBP-C en el contexto de la formación de puentes cruzados. En ausencia de fosforilación (arriba), la posición del sitio de unión a actina de cMyBP-C estaría a unos 3 nm del filamento delgado. La fosforilación de cMyBP-C (centro) extendería el puente cruzado a la superficie del filamento delgado y, por lo tanto, aflojaría el empaquetamiento de la porción de varilla de la molécula de miosina. El péptido permeabilizante 302A inhibe la interacción de la miosina con cMyBP-C (abajo), lo que da como resultado su movimiento hacia la actina, lo que a su vez da como resultado la formación de interacciones y puentes cruzados de actomiosina, lo que mejora la contractilidad.

La relevancia de la fosforilación de cMyBP-C se ha informado en múltiples modelos de roedores transgénicos al sustituir la serina de los sitios de fosforilación para imitar cMyBP-C activado, como el modelo de ratón transgénico DDD18,19. La reducción de los sitios de fosforilación en cMyBP-C puede contribuir a una disminución de la expresión de proteínas. Aquí, observamos que dicha fosforilación reducida se correlacionó con la expresión total reducida de cMyBP-C (Fig. 1). Recientemente, los estudios informaron sobre la entrega de ADNc de MYBPC3 para mejorar la función cardíaca. Se ha informado que una sola dosis sistémica de ADNc de MYBPC3 portador de AAV9 pudo restaurar los niveles de proteína y ARNm de MYBPC3 y prevenir el desarrollo de hipertrofia ventricular izquierda (HVI) en ratones knock-in dirigidos a MYBPC3 con solo un 20 % de cMyBP-C. proteína28. Otro estudio informó que el ADNc de MYBPC3 portador de AAV6 fue capaz de lograr una mejora similar en tejido cardíaco 3D diseñado29,30. Además, se ha demostrado que el ADNc de MYBPC3 portador de AAV9 suprime el desarrollo de hipertrofia en cardiomiocitos humanos derivados de iPSC de pacientes con MCH31. Sin embargo, el uso sostenido de AAV9 como terapia podría tener inconvenientes por la falta de conocimiento sobre la disposición celular y de todo el cuerpo, la relación dosis-exposición y la relación exposición-respuesta, así como el efecto de la inmunogenicidad en estas importantes propiedades32. Por lo tanto, la búsqueda de moléculas específicas dirigidas a cMyBP-C y su interacción proteína-proteína es fundamental para llevar una terapia eficaz del laboratorio a la cabecera. Nuestro estudio estuvo limitado por la escasa permeabilidad y estabilidad de los péptidos cMyBP-C, lo que restringió nuestros ensayos a entornos in vitro y ex vivo en los que utilizamos proteínas de miofibrillas y fibras musculares papilares permeabilizadas. Por lo tanto, estudios adicionales en un entorno in vivo con péptidos permeables y buena estabilidad permitirían una comprensión más completa de los mecanismos de modulación de cMyBP-C en la función cardíaca.

El modelo de rata con infarto de miocardio (IM) ha sido previamente caracterizado33. Veintiocho ratas macho Sprague-Dawley (SD) (Charles River Laboratories, Wilmington, MA), de entre 8 y 10 semanas de edad y con un peso de 180-250 g, se usaron para inducir IM mediante la arteria coronaria descendente anterior izquierda (LAD) ligadura Hemos seguido las pautas de ARRIVE durante todo el estudio para el manejo de animales. Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Ética Institucional para el Uso y Cuidado de Animales de Laboratorio en Merck & Co., Inc., Kenilworth, NJ, EE. UU. Brevemente, los animales se sometieron a una toracotomía del lado izquierdo bajo anestesia. Se cortó el saco pericárdico y se identificó la LAD. Se colocó un oclusor de arteria coronaria sin apretar alrededor de la LAD a ~ 2 mm por debajo del origen, y luego se tiró del oclusor para ligar la arteria coronaria. El infarto se definió por palidez y decoloración del ventrículo izquierdo y elevación del segmento ST en el ECG. Luego se cerró el cofre. Los animales fueron monitoreados de cerca por complicaciones quirúrgicas post-cirugía. Veintitrés ratas SD macho con edad y peso corporal similares se asignaron como animales simulados que recibieron una toracotomía similar para acceder al corazón y al cierre de la herida, pero sin ligadura de LAD. La evaluación post-IM para confirmar infartos se realizó mediante ecocardiografía el día 3, la semana 1, la semana 4 y la semana 8. Mientras tanto, se midieron los siguientes parámetros funcionales cardíacos globales: diámetro interior sistólico y diastólico final del VI (mm), diámetro interior sistólico y diastólico final del VI y volumen diastólico (µL), volumen sistólico (µL), gasto cardíaco (ml/min) y frecuencia cardíaca (BPM) (Figura complementaria S1). Los animales con infarto de pequeño tamaño y fracción de eyección (FE) > 40% fueron excluidos del estudio. Los cuatro puntos temporales de terminación fueron el día 3, la semana 1, la semana 4 y la semana 8. En cada punto temporal de terminación, se anestesiaron las ratas y se extirparon los corazones, se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C hasta su uso. .

Los modelos de ratón fosfomiméticos (DDD) y fosfoablados transgénicos específicos cardíacos descritos anteriormente de cMyBP-C con el promotor de cadena pesada de α-miosina se utilizaron para generar múltiples líneas de ratones FVB/N18,19,34,35. En resumen, los sitios de fosforilación clave conocidos (Ser-273, Ser-282 y Ser-302) en cMyBP-C y dos sitios de fosforilación potencialmente alternativos vecinos (Thr-272 y -281) se convirtieron en alanina (A) y ácido aspártico. (D) residuos usando métodos estándar basados en PCR. Todos los experimentos se realizaron según las pautas institucionales y fueron aprobados por el Comité de uso y cuidado de animales de la Universidad de Cincinnati. En este estudio se utilizaron ratones adultos de género mixto de 12 a 14 semanas de edad.

Los péptidos inhibidores de cMyBP-C se sintetizaron en los laboratorios de investigación de Merck & Co., Inc., Kenilworth, NJ, EE. UU. Todos los péptidos se caracterizaron mediante espectrometría de masas de alta resolución para tener valores de pureza confirmados cercanos o superiores al 90 % y valores de masa precisos en línea con los esperados en función de las secuencias. Las secuencias de los cuatro péptidos originales utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla 121. Los análisis de pureza y masa precisos se realizaron simultáneamente mediante LC-UV/MS de fase inversa utilizando un cromatógrafo de líquidos Waters ACQUITY I-class (Waters, Milford, MA) interconectado con un espectrómetro de masas Xevo G2-XS QTOF que funciona en el modo de ionización ESI +. Se utilizó una fase estacionaria Waters BEH C18, 1,7 μm, 130 Å, 2,1 × 150 mm (n.° de pieza 186003556) con ácido trifluoroacético al 0,1 % en agua destilada (dH2O) (A) y ácido trifluoroacético al 0,1 % en acetonitrilo (B) fases móviles . La columna se mantuvo isotérmica a 55 °C, con un gradiente lineal de 5 a 55 % de B durante 25 min, utilizando un caudal de 0,4 ml/min.

El nivel de fosforilación del dominio M de cMyBP-C en tres residuos de serina (p273, p282, p302) se determinó en ratas SD sometidas a cirugía MI utilizando el procedimiento Western Immunoassay (Wes) (ProteinSimple, Santa Clara, CA). Se lisó tejido de infarto del ventrículo izquierdo en un tampón RIPA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) suplementado con inhibidores de proteasa y fosfatasa. La estimación de proteínas se realizó según el kit (Pierce™ BCA Protein Assay Kit 23225, Thermo Fisher Scientific). Las muestras se prepararon según el protocolo de Wes, de acuerdo con las recomendaciones de ProteinSimple. Los anticuerpos utilizados para el estudio de expresión son los siguientes: Anti-cMyBP-C p273 (1:250), cMyBP-C p-282 (1:250), cMyBP-C p302 (1:250) (todos proporcionados mediante acuerdo de transferencia de material del Profesor Sakthivel Sadayappan, Facultad de Medicina, Universidad de Cincinnati); cMyBP-C total (Santa Cruz Cat # SC-137182, Lot # E2913 [1:5 para Wes]); cadena pesada de miosina (Abcam ab207926 (3-48G5C7); alfa actina (cardíaca) (Sigma-Aldrich A9357 clon AC1-20.4.2); troponina I (señalización celular 13083S [D6F8]); y troponina T (Sigma-Aldrich T6277 clon JLT-12) Los datos se normalizaron a las expresiones de las proteínas de mantenimiento α-actina o hipoxantina fosforribosil transferasa (HPRT) para igualar la cantidad de proteína cargada.

Los estudios de IHC se realizaron utilizando secciones de tejido cardíaco en serie de pacientes humanos adultos (sujetos normales, pacientes con MCH y pacientes con MCD). Todos los métodos se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas y regulaciones de Nanjing KeyGen BioTech Co., Ltd. y Nanjing GenScript Biotech Co., Ltd. Todos los protocolos experimentales se realizaron de acuerdo con las pautas y regulaciones y fueron aprobados por Affiliated Drum Tower Hospital, Medical Escuela de la Universidad de Nanjing. El Affiliated Drum Tower Hospital, Facultad de Medicina de la Universidad de Nanjing, obtuvo el consentimiento informado de todos los sujetos y/o su tutor legal. Brevemente, las secciones de tejido se desparafinizaron en xileno y se rehidrataron mediante lavados con alcohol graduado antes de la incubación con un bloque de peroxidasa (3% H2O2-metanol) a temperatura ambiente durante 10 minutos para inhibir la actividad de la peroxidasa endógena. Después de lavar con solución salina tamponada con fosfato (PBS), las secciones se bloquearon con albúmina de suero bovino al 1% (BSA, 50-100 μl) a temperatura ambiente durante 1 h para evitar la unión no específica del reactivo de detección. Después de lavar con PBS, las secciones se incubaron con el anticuerpo primario (50–100 μL; anticuerpos policlonales de conejo personalizados [GenScript, Piscataway, NJ]): p-273 (AFRRTpSLAGAGC), p282 (GAGRRTpSDSHEDAC) y proteína total (AFRRTSLAGAGC ) en una cámara húmeda a 4 ° C durante la noche. Después del lavado, las secciones se incubaron con un potenciador (50–100 μL) a temperatura ambiente durante 20 min y luego se lavaron con PBS. Luego, las secciones se incubaron con polímero ImmPRESS HRP PLUS (ratón/conejo, Vector Laboratories, Burlingame, CA) a temperatura ambiente durante 20 minutos y luego se lavaron con PBS. Luego se agregó una mezcla de cromógeno y sustrato de 3,3′-diaminobencidina (DAB) a temperatura ambiente durante aproximadamente 3 a 5 minutos para permitir el desarrollo adecuado del color. A continuación, la reacción se detuvo lavando las secciones con agua. Luego, las secciones se contrastaron con hematoxilina durante 15 minutos y se enjuagaron con agua. Finalmente, las secciones se deshidrataron en un enjuague con alcohol de grado ascendente que finalizó con un lavado con xileno. Se utilizó bálsamo neutro para cubrir las secciones. Se tomaron imágenes de los portaobjetos teñidos con un microscopio con un aumento de 200x o 400x para evaluar la expresión de proteínas. La expresión positiva de fosfoproteínas se determinó mediante la relación de la región positiva con el área total y se normalizó usando valores de expresión de proteína total.

Se realizó un ensayo de ATPasa en estado estacionario midiendo la liberación de fosfato inorgánico utilizando el método colorimétrico. La reacción de ATPasa se realizó en un tampón de reacción que consistía en Tris-HCl 15 mM, pH 7,5, KCl 10 mM, MgCl2 2 mM y EGTA 0,1 mM. La miosina y el dominio FL cMyBP-C y C0-C2 se realizaron en los laboratorios de investigación de Merck & Co., Inc., Kenilworth, NJ, EE. UU., con modificaciones de acuerdo con las referencias36,37. La actina se elaboró a partir de músculo esquelético de conejo, con modificaciones menores, en los mismos laboratorios de investigación38,39. Todas las proteínas utilizadas en el ensayo se diluyeron en un tampón de reacción. Se preparó una reacción de 30 µL añadiendo FL o cMyBP-C truncado (C0-C2), miosina (1 µM), F-actina (10 µM) y ATP (2 mM). La actina F se preparó a partir de actina G añadiendo KCl 50 mM y MgCl2 2 mM, seguido de un breve vórtex y una incubación de 30 min en hielo para la polimerización. La placa se centrifugó a 2000 rpm durante 15 s para ayudar a reducir las burbujas y la placa de reacción se incubó a 37 °C con agitación constante durante 60 min. La reacción se detuvo diluyendo las proteínas (1:20) en agua. Se transfirieron 30 µL de la mezcla de reacción 1:20 a una placa nueva y se añadió agua para completar hasta 200 µL según las instrucciones del kit (Abcam ab65622, Waltham, MA). También se prepararon estándares de fosfato según las instrucciones del kit. Finalmente, se agregaron 30 µL de reactivo de detección a todos los pocillos estándar y de muestra, se incubaron a TA durante 30 min con agitación constante y luego se leyeron en el punto final de 650 nm en SpectraMax (Molecular Devices, San Jose, CA).

La actividad ATPasa miofibrilar se determinó midiendo la liberación de fosfato inorgánico40. Las proteínas miofibrilares se aislaron y purificaron, como se informó previamente41,42, y se suspendieron en un tampón F60 con NaCl 500 mM. Estas proteínas se extrajeron de muestras de corazón de rata simulada y post-IM de la semana 1, así como de muestras de corazón de ratones transgénicos cMyBP-C (NTG, AAA y DDD). Luego se determinó la proteína mediante tinción con azul de Coomassie (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) de geles SDS-PAGE (Fig. S10 complementaria). La mezcla de reacción contenía de 0,25 a 0,5 mg/ml de proteínas miofibrilares, Tris-HCl 15 mM, KCl 10 mM, MgCl2 2 mM, EGTA 0,5 mM y ATP 5 mM (pH 7,0). Los ensayos se realizaron en una placa de microtitulación de 96 pocillos a concentraciones de pCa2+ (pCa) de 8,0 a 2,0 a 37 °C. La mezcla de reacción de 120 µL se incubó a 37 °C durante 15 min y se centrifugó a 1500 rpm durante 3 min. Cada 30 µL de sobrenadante se transfirió a una nueva placa de microtitulación de 96 pocillos y se mezcló con 170 µL de agua destilada (dH2O). Se añadió un reactivo de detección de 30 µl (Kit de ensayo de fosfato, Abcam) para crear una reacción para desarrollar color, después de lo cual se determinó calorimétricamente la producción de fosfato inorgánico a 625 nm utilizando un lector de microplacas cinético (Molecular Devices). La actividad de ATPasa estimulada por calcio se calculó restando la actividad en pCa 2,0 de la actividad en pCa 8,0.

Los corazones enteros se extirparon rápidamente y se lavaron con tampón Krebs-Henseleit 1x (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), seguido de la adición de 1 g de d-glucosa, 0,84 g de NaHCO3 y 0,76 g de BDM. Se cortó cada corazón para exponer cuidadosamente los músculos papilares en el LV. Como se describió previamente34, los músculos papilares se extirparon con un endoscopio de disección (V8 Stereo, PlanAPO S 0.63× FWD 81 mm, Zeiss, Dublin, CA) y se permeabilizaron durante la noche en Triton X-100 al 1 % prediluido al 10 % en solución relajante de montaje ( KOH 97,92 mM, ATP 6,24 mM, EGTA 10 mM, Na2CrP 10 mM, propionato de potasio 47,58 mM, BES 100 mM, MgCl2 6,54 mM y DTT 1 mM) a 4 °C para eliminar la membrana celular y las proteínas unidas a la membrana. A continuación, los músculos papilares se recortaron adicionalmente en haces de fibras de aproximadamente 1 mm de longitud bajo el microscopio de disección. Se seleccionaron haces de fibras rectas en base a la uniformidad y luego se unieron en cada extremo con clips en T de aluminio. Cada haz de fibras se lavó suavemente con una solución relajante fresca en hielo y se usó dentro de las 12 h. Luego, las fibras recortadas en t se unieron a un transductor de fuerza y un controlador de longitud de alta velocidad (Aurora Scientific, Inc., Aurora, ON, Canadá). Las dimensiones del músculo (área de la sección transversal, longitud) se determinaron utilizando un micrómetro ocular montado en el microscopio de disección (resolución, ~ 10 μM). Estas dimensiones musculares se utilizaron para normalizar la fuerza contráctil y la longitud del sarcómero. Este último se fijó en 2,0 μM y se controló continuamente a través del sistema de medición de longitud de sarcómero de vídeo de alta velocidad (HVSL) de Aurora. La fuerza y el avance de la unión de las fibras musculares se determinaron exponiendo las fibras unidas a la solución de activación máxima saturante de calcio al principio y al final del protocolo experimental. La fuerza isométrica en desarrollo se registró a concentraciones variables de calcio (pCa de 10,0 a 4,5) en presencia o ausencia de péptidos, y se restó el nivel de fuerza de referencia cero de todos los registros de fuerza en cada ciclo de activación. Todas las medidas de fuerza fueron corregidas por reducción y normalizadas al área de la sección transversal. Las fibras con más del 20 % de reducción se excluyeron del análisis de datos. Los datos se adquirieron utilizando el sistema de análisis y adquisición de datos musculares en tiempo real 600A de Aurora. Cada relación fuerza-calcio individual se ajustó a una ecuación de Hill modificada (Fuerza/Fuerzamax = [Ca2+]n/(pCa50n + [Ca2+]n) en la que n es la pendiente de Hill. De manera similar, la tasa de redesarrollo de tensión (ktr) fue también medido en fibras extraídas de tejido cardíaco AAA, DDD y NTG en pCa 4.5.

Todos los datos se representan como la media ± error estándar de la media (SEM), a menos que se indique lo contrario. El análisis estadístico se realizó utilizando GraphPad Prism (v 6.0, GraphPad Software, San Diego, CA). Los datos se analizaron usando un ANOVA de dos vías con la prueba post-hoc de Tukey. Se consideró estadísticamente significativo un valor de p < 0,05.

Alaninas no fosforiladas

Miocardiopatía dilatada

Ácidos aspárticos fosfomiméticos

Agua destilada

Volumen diastólico final

Fracción de eyección

Volumen sistólico final

Fuerza

Isotiocianato de fluoresceína

Longitud total

Miocardiopatía hipertrófica

Gen de la hipoxantina fosforribosil transferasa

Células madre pluripotentes inducidas por humanos

Tasa de reurbanización de la fuerza

Diámetro interno del ventrículo izquierdo al final de la diástole

Diámetro interno del ventrículo izquierdo al final de la sístole

cadena pesada de miosina

Infarto de miocardio

cadena ligera de miosina

no transgénico

α-tropomiosina

Troponina T

Troponina I

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Agradecemos a Iffet Armstrong, Diseñadora de presentaciones de investigación, Educación científica y médica en Merck Creative Studios por su ayuda en la preparación de la ilustración para la Fig. 7.

Mohit Kumar recibió el apoyo de una beca predoctoral de la American Heart Association (17PRE33630192). Sakthivel Sadayappan ha recibido apoyo de las subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud R01 AR078001, R01 HL130356, R38 HL155775 y R01 HL143490; Premios para Estudiantes Institucionales de Pregrado (19UFEL34380251) y Transformación (19TPA34830084) de la American Heart Association 2019; y apoyo de Novo Nordisk, Amgen, AstraZeneca, MyoKardia y Merck.

Estos autores contribuyeron por igual: Luqia Hou y Mohit Kumar.

Departamento Cardiometabólico, Merck & Co., Inc., 213 East Grand Ave., South San Francisco, CA, 94080, EE. UU.

Luqia Hou, Priti Anand, Yinhong Chen, Nesrine El-Bizri y Gayathri Swaminath

Investigación y desarrollo analítico, Merck & Co., Inc., South San Francisco, CA, 94080, EE. UU.

Chad J. Pickens

Discovery Chemistry, Merck & Co., Inc., South San Francisco, CA, 94080, EE. UU.

W. Michael Seganish

División de Salud y Enfermedades Cardiovasculares, Departamento de Medicina Interna, Heart, Lung and Vascular Institute, University of Cincinnati, Cincinnati, OH, 45267, EE. UU.

Mohit Kumar y Sakthivel Sadayappan

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LH y MK contribuyeron por igual a este trabajo. LH, MK, SS y GS concibieron y diseñaron los experimentos. LH, MK, PA, YC, NE y CP realizaron los experimentos y analizaron los datos experimentales. WMS ayudó a sintetizar los péptidos. LH MK y redactó el manuscrito. GS y SS asistido en la redacción, edición y revisión del manuscrito. Todos los autores leyeron el manuscrito.

Correspondencia a Gayathri Swaminath.

Sakthivel Sadayappan proporcionó consultoría y estudios de investigación en colaboración a la Fundación Leducq, Pfizer, Novo Nordisk, Amgen, AstraZeneca, MyoKardia, pero dicho trabajo no está relacionado con el contenido de este manuscrito. Los autores declaran no tener conflictos de interés con el contenido de este artículo.

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Reimpresiones y permisos

Hou, L., Kumar, M., Anand, P. et al. La modulación de la miosina por los péptidos de proteína C que se unen a la miosina cardíaca mejora la contractilidad cardíaca en modelos de insuficiencia cardíaca experimentales ex vivo. Informe científico 12, 4337 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-08169-1

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Recibido: 05 Octubre 2021

Aceptado: 03 de marzo de 2022

Publicado: 14 de marzo de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-08169-1

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